Caractérisation de l'environnement nucléaire nécessaire à la réplication du virus adéno-associé dans les cellules infectées par le virus herpès simplex de type 1
Résumé
Le virus adéno-associé (AAV) est un parvovirus humain qui se réplique seulement dans les cellules co-infectées par un virus auxiliaire, tel que l'adénovirus ou le virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV-1).
Nous avons entrepris une analyse protéomique de facteurs cellulaires et HSV-1 associés à la protéine Rep d’AAV et donc potentiellement recrutés dans les compartiments de réplication AAV (RC). Pour cela, nous avons développé une approche protéomique TAP/MS performante permettant de purifier spécifiquement les partenaires de la protéine Rep d’AAV induite après infection par HSV-1. L’approche protéomique est la méthode TAP (« Tandem Affinity Purification ») et est basée sur une double purification en utilisant les deux protéines Rep78 et Rep68 de l’AAV fusionnées à deux peptides de liaison à des résines d’affinités différentes.
Des mises au point techniques ont été nécessaires et ont permis d’établir les conditions d’infection des cellules pour lesquelles la réplication de l’AAV est optimum, de proposer un protocole modifié de double purification par la méthode TAP de façon à limiter au maximum la fixation non spécifique des protéines sur les deux résines. Nous avons alors purifié les complexes protéiques contenant Rep, puis identifié les partenaires de Rep par une analyse en spectrométrie de masse. Cette étude a abouti à l’identification d’environ 60 protéines cellulaires, parmi lesquelles des facteurs impliqués dans le métabolisme de l'ADN et l'ARN représentaient les plus grandes catégories fonctionnelles.
Les analyses de validation ont confirmé la présence de facteurs déjà connus pour participer à la réplication d’AAV in vitro, tels que les facteurs RPA, PCNA, RFC et des protéines du complexe MCM. Mais la plupart n’étaient pas connus comme partenaires de Rep tels que le complexe MRN (Mre11/Rad50/Nbs1), le complexe Ku70 et -86, et les protéines de réparation des mésappariements MSH2, MSH3 et MSH6.
De plus, une dizaine de protéines virales ont été identifiées comme partenaires de Rep dont l’exonucléase virale UL12 jamais décrite jusqu’à ce jour comme participant à la réplication de l’ADN d’AAV.
Au total, ces analyses fournissent la base pour comprendre comment AAV adapte sa stratégie de réplication dans un environnement nucléaire induit par le virus helper HSV-1.
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