Développement d'une technique d'identification des protéines associées à un locus spécifique
Résumé
L’état de la chromatine et les éléments de régulation des gènes tels que les promoteurs permettent la régulation de l’expression génique. Actuellement, des techniques ciblées tels que l’immunoprécipitation de la chromatine (CHIP) sont principalement utilisées pour l’étude de la biologie de la chromatine. La purification des protéines associées au niveau des éléments de régulation des gènes de façon non biaisée permettrait de mieux comprendre leur activation ou leur répression au cours du développement ou lors de maladies. De plus, les protéines identifiées seraient susceptibles d'apporter de nouvelles connaissances pour le diagnostic ou la thérapie de ces maladies. Ces 10 dernières années différentes techniques de purification d’un locus unique ont été développées. En effet, pour enrichir un locus unique de 3kbp soit 0.0001% du génome humain, le taux d’enrichissement doit être de 1 million de fois pour obtenir un mélange quasi-homogène. Les techniques actuellement publiées utilisent majoritairement des systèmes CRISPR/deadCas9. La protéine dCas9 est une grosse protéine (>150kDa). Son efficacité de liaison pourrait par conséquent être fortement influencée par la structure de la chromatine. En outre, la liaison de la protéine dCas9 pourrait concurrencer la liaison d’interacteurs biologiques endogènes. La compréhension de l’impact de ce type de système sur la composition locale de chromatine est un point clé pour évaluer l’efficacité de ces techniques. D’autres systèmes basés sur l’utilisation de sondes de captures ont été développés. Ces techniques, comme celles utilisant dCas9 ne comportent qu’une seule étape de purification par affinité ce qui ne permet pas d’obtenir un taux d’enrichissement suffisant pour la caractérisation d’un locus unique. Dans une première partie, l’impact de la protéine dCas9 sur la composition locale de la chromatine est étudiée au niveau d’un locus spécifique. Dans une seconde partie, une nouvelle technique de purification d’un locus unique basée sur l’utilisation de sondes de capture est développée. Il s’agit d’une adaptation de la technologie PICh (Proteomics of isolated chromatin segments) rendue très sensible et quantitative, et avec un taux d’enrichissement augmenté grâce à l’ajout d’une seconde étape de purification par affinité.
Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)