Production d'une protéine de la matrice extracellulaire de la peau en vue de sa caractérisation moléculaire
Résumé
La laminine 332, constituée de l’assemblage des sous-unités α3, β3 et γ2, est la protéine d’adhérence majeure et irremplaçable de l’épiderme. Elle est synthétisée exclusivement par les kératinocytes sous forme d’un précurseur. Après sa sécrétion et sa déposition dans la matrice extracellulaire, les sous-unités α3 et γ2 subissent un clivage post traductionnel extracellulaire de leurs extrémités C-terminale et N-terminale. La protéolyse de ces chaînes donne ainsi naissance à la forme tissulaire mature avec perte des globules LG45. Actuellement, la structure moléculaire du domaine LG45 n’a pas été résolue. Notre étude a consisté à tenter de produire et purifier en grande quantité la protéine LG45 afin de déterminer sa structure cristallographique. Sa résolution permettrait d’obtenir de nombreuses informations moléculaires et ainsi de mieux appréhender la fonction de la protéine, notamment son mode de liaison au syndécan-1 et son implication dans le processus de migration des kératinocytes. Le premier objectif de ces travaux a été d’obtenir une quantité de protéine suffisante pour réaliser les études structurales. Différentes techniques de production en système eucaryote ont été employées. Deux stratégies de transfection ont été mises au point afin que les cellules HEK-293 EBNA surexpriment la protéine LG45 et plusieurs systèmes de production à grande échelle ont été testés. Le domaine LG45 a tout d’abord été exprimé de façon stable dans des cellules HEK-293-EBNA et produit dans différents bioréacteurs (CELLine, EasyFill, TripleFlask). Les rendements obtenus avec chaque système ont été comparés ainsi que leurs avantages et inconvénients. Les premiers résultats ont révélé la précipitation de la protéine lors de sa congélation. Pour pallier à ce problème et dans le but de faciliter les études de cristallographie, des protéines LG45 mutées sur plusieurs sites de glycosylation ont été surexprimées par transfection transitoire dans des cellules HEK-293 EBNA. Des agrégats ont été retrouvés dans l’échantillon purifié et concentré rendant la formation de gouttelette de cristallisation impossible. Une protéine de 65 kDa retrouvée dans nos échantillons a également été identifiée par spectrométrie de masse. L’antithrombine III présente dans le sérum a une affinité pour l’héparine et a été éluée au même moment que notre protéine. Les cellules HEK-293 EBNA sont actuellement adaptées en milieu défini sans sérum et des essais de transfection sont en cours afin d’optimiser la production du domaine LG45 dans ce milieu.
Domaines
Sciences du Vivant [q-bio]
Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)