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. .. Objectif,

. .. Consignes-de-sécurité,

. .. Matériel-utilisé,

. .. Réactifs,

. .. Opérations-préalables,

. .. Protocole-expérimental,

, Hygiène et élimination

.. .. ,

. .. Fiche-de-visas, , vol.10

, Préparer les bloquants d'adaptateurs P5/MP7 pour avoir un mélange à 50µmol/L each >Hybridation1 20 µL "Multiplex-block-P7" à 100 µM (stock MWG) + 20µL "Univ-block-P5" à 100 µM (stock MWG)

, Préparer une dilution de ces bloquants d'adaptateurs P5/MP7 au 1/5 ème > Hybridation 2 4µL de la solution bloquants d'adaptateurs P5/MP7 à 50µmol/L each + 16 µL d'eau UP B-Préparation de Bloquants microsatellites (si besoin, vérifier les stocks) de chaque bloquants microsats

, Préparer une dilution de ces bloquants microsatellites au 1/10 ème > Hybridation 2 2µL de la solution bloquants microsatellites à 33 µmol/L each + 18 µL d'eau UP C-Dilution du « Sequence Capture Developer Reagent

. Diluer-au-½-le-«-sequence, Capture Developer Reagent » (produit Roche) > Hybridation 2 20µL de « Sequence Capture Developer Reagent » + 20 µL d'eau UP D-Préparation du tampon d'élution (si besoin

?. Sortir-À-température-ambiante, SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit (stocké à -20°C) -Les billes : DYNABEADS -STREPTAVIDIN -C1 (stokes à 4°C), vol.1

, Placer le tube sur le support magnétique pendant 2min ? Enlever et jeter de surnageant. ? Enlever le tube du support magnétique ? Ajouter 100 µL de «1 X Bead Wash Buffer » ? Mélanger par pipetage UP and DOWN ? Placer le tube sur le support magnétique 2 minutes ? Enlever et jeter de surnageant. ? Enlever le tube du support magnétique ? Ajouter 100 µL de «1 X Bead Wash Buffer » ? Mélanger par pipetage UP and DOWN ? Placer le tube sur la plaque magnétique 2 minutes ? Enlever et jeter le surnageant. ? Enlever le tube du support magnétique ? Ajouter 50 µL de «1 X Bead Wash Buffer » (1V) ? Mélanger par pipetage UP and DOWN ? Transférer la totalité avec le même cône dans un tube de 0.2 mL ?, ? Préparer les dilutions des solutions de lavages dans des tubes de 1.5mL: Volumes pour 1 hybridation: hybridation : ? Bien mélanger les billes ? Mettre 50 µL de billes dans un tube de 1.5 mL ?

, Faire un pulse et replacer sur la plaque magnétique pour bien enlever tout le

A. Le-même-cône, Ajouter les 15 µl d'hybridation au tube contenant les billes streptavidine C1 ? Mélanger par pipetage UP and DOWN ? Incuber les tubes 45 minutes à 47°C Attention : Mélanger les billes toutes les 15 minutes par pipetage UP and DOWN -->Pendant l'immobilisation : ? Allumer le bain marie à sec à 47 °C ? Préchauffer les solutions Wash buffer 1, 2, 3 et 4 diluées au 1 X au bain marie à sec à 47°C pendant les 45min d'immobilisation Stringent Wash Buffer, Biotine/Streptavidine ? Faire un pulse rapide des tubes contenant les hybridations ?, p.47

, Placer le tube sur le support magnétique 1 minute ? Enlever et jeter de surnageant ? Enlever le tube du support magnétique ? Ajouter 200 µl de « 1 X Stringent Wash Buffer » préchauffé ? Mélanger par pipetage et incuber 5 minutes dans le bain marie à 47°C

. ?-placer-le-tube-sur-le-support-magnétique-1-minute-?-enlever, ?. Jeter-de-surnageant, and . Ajouter, µl de « 1X Wash Buffer 1 » préchauffé aux billes ? Vortexer 2 minutes et faire un pulse très rapide ? Placer le tube sur le support magnétique 1 minute ? Enlever et jeter de surnageant ? Enlever le tube du support magnétique ? Ajouter 200 µl de « 1X Wash Buffer 2 » préchauffé ? Vortexer 1 minute et faire un pulse très rapide ? Placer le tube sur le support magnétique 1 minute ? Enlever et jeter de surnageant ? Enlever le tube du support magnétique ? Ajouter 200 µl de « 1X Wash Buffer 3 » préchauffé ? Vortexer 30 secondes et faire un pulse très rapide ? Placer le tube sur le support magnétique 1 minute ? Enlever et jeter de surnageant ?

, -Préparation des solutions de lavage ? Sortir à température ambiante : ? Les solutions de lavages: Wash Buffer 1, 2, 3, 4 et 7 Kit: SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit

, ? Les billes : DYNABEADS -STREPTAVIDIN -C1 (stokes à 4°C)

, Placer le tube sur le support magnétique pendant 2min ? Enlever et jeter de surnageant. ? Enlever le tube du support magnétique ? Ajouter 100 µL de «1 X Bead Wash Buffer » ? Mélanger par pipetage UP and DOWN ? Placer le tube sur le support magnétique 2 minutes ? Enlever et jeter de surnageant. ? Enlever le tube du support magnétique ? Ajouter 100 µL de «1 X Bead Wash Buffer » ? Mélanger par pipetage UP and DOWN ? Placer le tube sur la plaque magnétique 2 minutes ? Enlever et jeter le surnageant, ? Préparer les dilutions des solutions de lavages dans des tubes de 1.5mL: Volumes pour 1 hybridation: hybridation : ? Bien mélanger les billes et mettre 50 µL de billes dans un tube de 1.5 mL ?

, Placer le tube sur la plaque magnétique 2 minutes ? Enlever et jeter le surnageant

, Laisser sécher 2 ou 3 minutes à TA 10-Immobilisation : Biotine/Streptavidine ? Faire un pulse rapide des tubes contenant les hybridations ? Ajouter les 15 µl d'hybridation au tube contenant les billes streptavidine C1 ? Mélanger par pipetage UP and DOWN ? Incuber les tubes 45 minutes à 47°C Attention : Mélanger les billes toutes les 15 minutes par pipetage UP and DOWN. -->Pendant l'immobilisation : ? Allumer le bain marie à sec à 47 °C ? Préchauffer les solutions Wash buffer 1, 2, 3 et 4 diluées au 1 X au bain marie à sec à 47°C pendant les 45min d'immobilisation Stringent Wash Buffer, ? Faire un pulse et replacer sur la plaque magnétique pour bien enlever tout le liquide ?

, Placer le tube sur le support magnétique 1 minute ? Enlever et jeter de surnageant ? Enlever le tube du support magnétique ? Ajouter 200 µl de « 1 X Stringent Wash Buffer » préchauffé ? Mélanger par pipetage et incuber 5 minutes dans le bain marie à 47°C

. ?-placer-le-tube-sur-le-support-magnétique-1-minute-?-enlever and . Jeter-de-surnageant, Ajouter 200 µl de « 1X Wash Buffer 1 » préchauffé aux billes ? Vortexer 2 minutes et faire un pulse très rapide ? Placer le tube sur le support magnétique 1 minute ? Enlever et jeter de surnageant ? Enlever le tube du support magnétique ? Ajouter 200 µl de « 1X Wash Buffer 2 » préchauffé ? Vortexer 1 minute et faire un pulse très rapide ? Placer le tube sur le support magnétique 1 minute ? Enlever

, Réaliser la PCR sur les 22µL de HYB1 et les 22µL de HYB2 pour chaque capture Attention : utiliser des index différents

, Dans les 22µL de Capture: ? Distribuer 1.5 µl d'amorce Sol PE-PCR F à 10µM ? Distribuer 1.5 µl d'amorce Sol MPE-PCR R (avec Index) à 10µM ? Distribuer 25µl 2X KAPA HiFi HotStart Ready mix ? Mélanger par up and down, vol.50

, Purif AMPure XP (1.8V): Eliminer enzyme + tampon ? Ajouter 1.8V de billes (30µL de billes puis 60 µL de HMS) dans les puits

, Depuis le début de sa domestication dans le croissant fertile, il y a 12 000 ans, le blé dur, Triticum turgidum a subi de nombreux évènements démographiques et sélectifs. La première transition caractérisant le passage du blé dur sauvage (amidonnier sauvage) Triticum turgidum spp dicoccoïdes

. Triticum, Ce caractère, contrôlé notamment par les gènes Br, a permis aux premiers agriculteurs de récolter, sur les plantes, le grain à maturité. La deuxième transition s'est produite entre l'amidonnier cultivé et Triticum turgidum spp durum. Elle est caractérisée par l'apparition des grains nus permettant un battage plus facile (caractère contrôlé notamment par le gène Q). La dernière transition majeure intervient lors de la révolution verte, dans les années 1960, et marque le passage des « populations de pays » aux variétés « élites », sélectionnées pour de nombreux caractères morphologiques comme une taille réduite (gène Rht)

B. Dans-le, affiner nos connaissances sur l'histoire évolutive de l'espèce Triticum turgidum, nous avons produit un jeu de données moléculaires en utilisant la méthode d'enrichissement par capture (10 000 régions de 120pb situées dans la partie codante du génome) pour contourner les difficultés liées à la grande taille de son génome

, Cette étude a été réalisée sur 120 génotypes, 30 pour chacune des quatre formes évolutives précédemment citées

, Zhu et al. 2019), nous a également permis d'observer la variation du niveau de diversité le long du génome pour chacune des quatre formes évolutives. Nous avons observé que certaines zones ont vu leur niveau de diversité considérablement diminuer au cours de la domestication, alors que d'autres sont encore très polymorphes. Nous avons également pu détecter des signatures de sélection, sur ces quatre formes, d'abord sans a priori, puis en ciblant les locus impliqués dans l'expression de traits phénotypiques caractéristiques de la domestication (locus Br, Q et Rht) ainsi que deux QTLs impliqués dans le poids des grains et la teneur en azote dans la feuille, 2017.

, Ce travail a permis de proposer de nouvelles perspectives pour le développement d'outils moléculaires et des nouvelles pistes pour affiner notre compréhension de l'histoire évolutive de l'espèce Triticum turgidum