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, La bande de gel découpée est traitée selon le protocole utilisé à l'IPBS, pour le lavage, la digestion trypsique et l'extraction des peptides

, Les peptides générés sont ensuite analysés par spectrométrie de masse

A. , Analyse par Spectrométrie de masse : NanoLC/ESI LTQ-Orbitrap Velos ETD MS/MS Descriptif des analyses

, L'extrait peptidique sec est repris dans 14µL d'une solution 2% acétonitrile / 0,05% acide trifluoroacétique. Pour l'analyse en MS, 5µl d'extrait peptidique sont injectés et le reste est conservé à-20°C

, Méthode d'acquisition, pp.60000-60001

B. , Analyse Bioinformatique : validation et quantification des données

, Les données brutes ont été obtenues après recherche avec le moteur de recherche MS-Angel dans la banque Gallus-Gallus et Influenza A virus Les listes de protéines ainsi crées sont ensuite validées par le logiciel Proline

L. Brièvement and . Trypsine, P est utilisée comme enzyme et un clivage manqué est autorisé. L'oxydation des méthionines est définie comme modifications variables et la carbamidométhylation des cystéines est définie comme modification fixe

, Les peptides et protéines sont validés en générant une banque peptidique aléatoire « decoy », où le seuil de faux positifs (FDR) est fixé à 1%, La validation des données est effectuée grâce au logiciel Proline

, Les protéines identifiées avec exactement le même jeu de peptides (samesets) ou avec une partie du même jeu de peptides (subsets) sont regroupées sous formes de listes dans des tableaux Excel

, Les protéines d'un même groupe sont classées selon leur score protéique, leur nombre de séquence peptidiques (spécifiques ou non de la protéine), leur nombre de spectres MSMS qui sont les spectres de fragmentation. Seul un membre du groupe est reporté dans la liste des protéines identifiées

, En effet, dans une expérience LC-MS, l'intensité du signal lorsque le peptide est élué de la colonne chromatographique peut être suivi au cours du temps. L'aire sous la courbe du pic chromatographique d'un peptide est linéairement dépendante de sa quantité. L'intégration de cette aire sur l, La quantification « Label-free » a été réalisée sur Proline. L'approche «

, Afin de pouvoir calculer les ratios, les valeurs manquantes ont été remplacées par une valeur de bruit de fond qui est calculée par le centile 1% des intensités brutes de chaque condition, Le logiciel Proline réalise une normalisation des données entre tous les échantillons analysés. Cependant, certaines protéines n'ont pas été identifiées et/ou détectées dans certaines conditions

, Les interrogations ont été effectuées sur la banque Gallus-Gallus et Influenza A virus Les protéines identifiées ont été validées automatiquement dans Proline avec les paramètres décrits cidessus et des listes de protéines ont été générées

, Afin d'augmenter la robustesse des résultats, les listes obtenues sont ensuite filtrées afin de ne valider que les protéines identifiées avec au moins 2 peptides et 4 MS/MS (les protéines non validées par les filtres sont grisées dans les tableaux résultats)

, Les listes complètes des protéines identifiées pour ces 2 échantillons dans la banque Gallus-Gallus sont exportées sous forme de fichiers Excel : 160824_S2_Recherche en banque Gallus Gallus Le nombre de protéines identifiées dans la banque Gallus-Gallus: MD01_Ni : 214 protéines MD02_Ni: 186 protéines MD03_Inf: 218 protéines MD04_Inf, p.177

, Les listes complètes des protéines identifiées pour ces 2 échantillons dans la banque Influenza Avirus sont exportées sous forme de fichiers Excel : 160907_S2_Recherche en banque InfluenzaAVirus Le nombre de protéines identifiées dans la banque Influenza: MD01_Ni : 0 protéines MD02_Ni: 0 protéines MD03_Inf: 402 protéines MD04_Inf: 256 protéines NB : dans les échantillons MD01 et MD02, NS1 est identifiée mais ne passe pas les filtres de validation

, La liste des protéines identifiées se trouve dans l'onglet proteins sets

, Protocole de Duolink ? PLA, vol.4

, PRIMARY ANTIBODIES Dilute the primary antibodies in appropriate buffer and apply to samples. Incubate. Wash in suitable buffer for 2 × 5 min

, Incubate for 60 min at +37°C. Wash in 1x Wash Buffer A for 2 × 5 min 4. LIGATION Dilute the Ligation stock 1:5 in H 2 O. Dilute the Ligase at 1:40 in the solution and apply the mix to samples. Incubate for 30 min at +37°C, PLA® PROBES Dilute the two PLA probes 1:5 in appropriate buffer and apply to samples

, AMPLIFICATION Dilute the Amplification stock 1:5 in H 2 O. Dilute the Polymerase at 1:80 in the solution and apply the mix to samples. Incubate for 100 min at +37°C