Fabrication de cellules souches embryonnaires humaines exprimant un marqueur fluorescent de la pluripotence grâce à la technologie CRISPR/Cas9

Résumé : Le développement de nouvelles technologies comme CRISPR/Cas9 facilite la création de mutations ciblées dans le génome des cellules souches embryonnaires humaines. Cette technologie, découverte et caractérisée en 2012, ne cesse de se développer. Au départ, il existait uniquement la Cas9 sauvage qui crée une cassure double-brin à bouts francs dans la cellule. Très vite, la méthode de la Cas9_D10A (double nickase) s’est développée pour palier au manque de spécificité de la précédente méthode. Enfin la nucléase Cpf1 a été ensuite découverte et est utilisée pour effectuer des modifications génétiques. La nucléase Cpf1 est plus spécifique et efficace que les précédentes méthodes. Je rapporte dans ce mémoire la création d’une lignée de cellules souches embryonnaires humaines dont le gène de pluripotence OCT4 est fusionné au gène Katushka par la méthode de la « double nickase » de la technologie CRISPR/Cas9. Pour cela j’ai construit le vecteur permettant de créer la cassure double brin dans le locus du gène OCT4 et j’ai modifié la matrice de réparation contenant le gène Katushka ainsi que la cassette de sélection à un antibiotique. L’analyse des clones cellulaires se fait en deux étapes. Cela implique, premièrement la sélection des clones résistants à l’antibiotique et l’identification des clones correctement ciblés, deuxièmement l’analyse de l’expression de la protéine fluorescente par microscopie et cytométrie en flux, avant et après l’excision de la cassette de sélection. Enfin, je présente en perspective les expériences à réaliser pour arriver à obtenir des cellules souches embryonnaires humaines exprimant un marqueur fluorescent de la pluripotence dite « naïve ». Ces expériences demanderont de réaliser une nouvelle intégration d’un gène de fluorescence dans le locus d’un gène spécifique de l’état naïf. Cette modification génomique fera également intervenir la technologie CRISPR/Cas9.
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Contributeur : Antoine Cadiou <>
Soumis le : jeudi 1 février 2018 - 11:45:52
Dernière modification le : samedi 3 février 2018 - 01:17:38
Document(s) archivé(s) le : mercredi 2 mai 2018 - 14:28:11

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Antoine Cadiou. Fabrication de cellules souches embryonnaires humaines exprimant un marqueur fluorescent de la pluripotence grâce à la technologie CRISPR/Cas9 . Génétique humaine. 2018. ⟨hal-01698430⟩

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