CONSTRUCTION DE SOUCHES Trichoderma reesei FLUORESCENTES POUR UN CRIBLAGE HAUT-DEBIT DE TRANSFORMANTS PAR CYTOMETRIE EN FLUX

Hugues Mathis (1, 2)

1 EPHE - École Pratique des Hautes Études
2 IFPEN - IFP Energies nouvelles

L’objectif de l’étude était de déterminer la faisabilité d’un criblage haut-débit de spores fongiques issues de transformation, permettant l’insertion d’un transgène d’intérêt. Cette étape est aujourd’hui dépendante de marqueurs antibiotiques assurant la sélection des clones. Une alternative a été identifiée via des marqueurs fluorescents, présentant l’avantage de ne pas créer de souches potentiellement multi-résistantes, mais aussi d’être réutilisés successivement (recyclage possible). Cependant, leur mise en œuvre repose sur la capacité à détecter la fluorescence, si possible à haut-débit du fait du faible rendement de transformation (30 pour 1 million). C’est dans ce contexte qu’un protocole de cytométrie en flux (CMF) a été évalué pour sélectionner des spores fongiques. Pour cela, de nombreux paramètres ont dû être adaptés (vitesse, concentration, taille, intensité laser, débit…) pour parvenir à la détermination d’un fenêtrage dédié, permettant d’identifier les spores fluorescentes viables, des spores non fluorescentes et/ou sénescentes. Une fois l’outil mis en place, huit promoteurs constitutifs et quatre constructions contenant le promoteur de cellulases pCBHI ont été étudiés. Ce criblage a également permis de comparer deux variants de la Green Fluorescent Protein (GFP) : L et EGFP. Ce-dernier a été issu d’une optimisation de codons, afin d’obtenir un variant EGFP dédié à l’étude de T. reesei. Celui-ci a donné les meilleures expressions de fluorescence, en particulier lorsqu’il était placé sous le contrôle du promoteur pTEF, pPKI ou pCBHIC. Le suivi cinétique de l’intensité fluorescente de t0 à t+24h, combiné aux indicateurs de viabilité cellulaires ont également permis de suivre à la fois la croissance et l’expression de la protéine d’intérêt. De plus, la comparaison de 9 transformants pTEF-EGFP a permis de mettre exergue un effet transformant conséquent, soit une variation de l’expression de fluorescence de l’ordre de x 2,5. En conclusion, la présente étude a établi la faisabilité d’un passage des marqueurs de sélection de type antibiotique vers une alternative fluorescente. Pour cela, la CMF offre un fort potentiel pour la détection haut-débit qui sera nécessaire à l’analyse de millions de clones. Diverses perspectives ont été proposées, notamment en s’appuyant sur un trieur cellulaire afin d’isoler la population transformée par CMF.

Keywords: Spores; Cytométrie de flux; GFP; Fluorescence; Trichoderma reesei; Transformation; Promoteur

Domains: Biotechnology

Hugues Mathis. CONSTRUCTION DE SOUCHES Trichoderma reesei FLUORESCENTES POUR UN CRIBLAGE HAUT-DEBIT DE TRANSFORMANTS PAR CYTOMETRIE EN FLUX. Biotechnologies. 2016. ⟨hal-01467645⟩