Establishment of drug target deconvolution approach for leishmanicidal compounds
Etablissement d’une approche de déconvolution de cibles pour des composés leishmanicides Ecole Pratique des Hautes Etudes Mémoire préparé sous la direction de Gérald Späth, Najma Rachidi et Sylvie Demignot
Résumé
Currently, medicines used to treat leishmaniasis have many serious side effects and their use is greatly compromised by the appearance of resistant parasites. It is therefore urgent and necessary to obtain new drugs to fight the disease effectively. In recent years, pharmaceutical companies have carried out screening campaigns that have identified thousands of compounds with a leishmanicidal effect. However, since their targets are unknown, these compounds are difficult to optimize, which in the long term could lead to side effects for the drugs derived from these compounds. Thus, deconvolution of targets has become a major issue, since it allows the identification of the primary and / or secondary targets of the compounds in order to understand their mechanism of action and to promote their optimization. We carried out a screening campaign which allowed us to identify a dozen potential inhibitors of kinases effective against the parasite. In order to determine their targets, I have developed a deconvolution strategy adapted to these inhibitors which consists initially in a selective enrichment of the Leishmania ATP binding proteins (ATPome) by ATP affinity chromatography , Then in a second stage in a competition by the compound of interest. The method of enrichment was very effective since it made it possible to obtain the first ATPome never realized in the trypanosomatids with the identification of 1177 proteins with potential ATP binding, including 205 annotated proteins for the binding function to ATP (Gene Ontology: 0005524), including 80 kinases and about 80 hypothetical proteins with an ATP binding domain or known ATPase function but not annotated. I then optimized the stage of competition and established the proof of concept using a known inhibitor-kinase pair. Finally, by combining this method with 2D-DiGE, I established a fast, visual and semi-quantitative method that allows me to determine whether inhibitors are broad-spectrum or specific; Only the latter will be optimized. This method thus makes it possible to visually determine the efficiency and the specificity of the competitive compounds of ATP. Using this approach, of the ten compounds initially obtained by screening, I was able to select two that were specific. For these two compounds, the targets will be identified by mass spectrometry.
Aujourd’hui, les médicaments utilisés pour traiter la leishmaniose ont de nombreux effets secondaires graves et leur utilisation est fortement compromise par l’apparition de parasites résistants. Il devient donc urgent et indispensable d’obtenir de nouveaux médicaments pour combattre efficacement la maladie. Ces dernières années, les compagnies pharmaceutiques ont réalisés des campagnes de criblages qui ont permis d’identifier des milliers de composés présentant un effet leishmanicide. Toutefois, comme leurs cibles sont inconnues, ces composés sont difficiles à optimiser, ce qui à terme pourrait entrainer des effets secondaires pour les médicaments dérivés de ces composés. Ainsi, la déconvolution de cibles, est devenue un enjeu majeur, puisqu’elle permet l’identification des cibles primaires et/ou secondaires des composés afin de comprendre leur mécanisme d’action et de favoriser leur optimisation. Nous avons réalisés une campagne de criblage qui nous a permis d’identifier une dizaine d’inhibiteurs potentiels de kinases efficaces contre le parasite. Afin de déterminer leurs cibles, j’ai développé une stratégie de déconvolution adaptée à ces inhibiteurs qui consiste dans un premier temps en un enrichissement sélectif des protéines de liaison à l’ATP de Leishmania (ATPome) par chromatographie d’affinité à l’ATP, puis dans un deuxième temps en une compétition par le composé d’intérêt. La méthode d’enrichissement a été très efficace puisqu’elle a permis d’obtenir le premier ATPome jamais réalisé chez les trypanosomatidés avec l’identification de 1177 protéines de liaisons à l’ATP potentielles, comprenant 205 protéines annotées pour la fonction de liaison à l’ATP (Gene Ontology : 0005524), dont 80 kinases et environ 80 protéines hypothétiques avec un domaine de liaison à l’ATP ou une fonction ATPase connue, mais non annotés. J’ai ensuite optimisé l’étape de compétition et établi la preuve de concept en utilisant un couple inhibiteur-kinase connu. Finalement, en combinant cette méthode avec la 2D-DiGE, j’ai établi une méthode rapide, visuelle et semi-quantitative qui me permet de déterminer si les inhibiteurs sont à large spectre ou spécifiques ; seuls ces derniers seront optimisés. Cette méthode permet donc de déterminer visuellement l’efficacité et la spécificité des composés compétitifs de l’ATP. En utilisant cette approche, sur les dix composés initialement obtenus par criblage, j’ai pu en sélectionner deux qui soient spécifiques. Pour ces deux composés, les cibles seront identifiées par spectrométrie de masse.
Sciences de la Vie et de la Terre Etablissement d'une approche de déconvolution de cibles pour des composés leishmanicides Olivier LECLERCQ 8 décembre 2016 Soutenu devant le jury suivant : Flore RENAUD, présidente Gerald SPÄTH, tuteur scientifique Najma RACHIDI, co-tutrice scientifique Sylvie DEMIGNOT, tutrice pédagogique Sébastien POMEL, rapporteur Christian MITRI, examinateur
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